产品货号：
KL220732
中文名称：
单细胞cDNA扩增试剂盒(T7体外转录法)
英文名称：
Single Cell cDNA Amplification Kit
产品规格：
200T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
产品特点：
产品组成：
保存：按标签指示条件保存，有效期一年
使用方法：
一、单细胞制备（本试剂盒不含相关试剂，下列操作步骤仅供参考。）
二、单细胞cDNA合成
三、第一轮cDNA扩增
四、第二轮或更多轮cDNA扩增
相关搜索：单细胞cDNA扩增试剂盒(T7体外转录法)，Single Cell cDNA Amplification Kit
单细胞是非常重要的实验材料，但是由于单细胞中的RNA很少，平均只有约10pg总RNA，0.1pg mRNA。但拷贝算，一个小鼠胚胎干细胞只有2万多个mRNA分子，一个小鼠成纤维细胞只有50万个mRNA分子。因此常常需要将其逆转录成cDNA后，对cDNA进行扩增，方便后续使用。扩增的方法主要有PCR和体外转录法。本制品是基于T7体外转录法开发的cDNA扩增试剂盒。
产品特点：
- 一站式，即开即用，用户不用单独购买原料并进行优化。
- 直接用1～500个真核细胞为起始材料，最后得到cDNA单链。本制品不适用于mRNA没有polyA尾巴的细胞，但可以定做本制品的改良型。
- 基于T7 IVT线性扩增而非PCR扩增，避免了PCR扩增的偏向性。
- 单链和双链cDNA合成一管完成，减少了多步操作。
- 可以进行1次或多次扩增，每次扩增可以将拷贝数提升上万倍。
- 基于磁珠法合成，可以反复使用至少5次，极大提高了效率。
- 所得cDNA单链可以用于后续实验。如果加入自备的标记核苷酸，还可以进行单细胞cDNA标记，用于后续芯片杂交。
- 提供可以spike in的阳性对照，方便检测各步效果。
- 本制品足够进行200次10L体系单细胞逆转录反应和10μL体系的cDNA扩增。本制品不含单细胞制备试剂盒。
产品组成：
| 包装 | 组分 | 规格 | 保存 |
| 包装一 | RT-专用磁珠 | 200μL | -20℃ |
| 磁珠RT反应液1 | 500μL | ||
| 磁珠RT反应液2 | 500μL | ||
| 磁珠RT专用酶 | 100μL | ||
| PC冻干粉 | 5E4拷贝 | ||
| 模板稀释液 | 1mL | ||
| 2×磁珠IVT反应液 | 2mL | ||
| 磁珠IVT酶 | 200μL | ||
| 4×RT反应液 | 1mL | ||
| MMLV酶 | 200μL | ||
| 超纯水 | 1mL | ||
| 2×Probe PCR Mix | 300μL | ||
| 引物探针混合液 | 30μL | ||
| 包装二 | 磁珠IVT预洗液 | 50mL | 室温 |
| 微量核酸沉淀剂 | 15mL | ||
| 8孔磁力架 | 1个 |
保存：按标签指示条件保存，有效期一年
使用方法：
一、单细胞制备（本试剂盒不含相关试剂，下列操作步骤仅供参考。）
- 用户需要根据样本细胞种类选用合适的方法（如胰酶消化）制备单细胞悬液，使得每μL悬浮液中平均有1个细胞。对已经处于单细胞悬浮状态的细胞（如卵细胞）并且浓度在1个细胞/μL左右，则可以跳过此步。悬浮液必须使用PBS，其他悬浮液可能跟本试剂盒不兼容，用前需要咨询本公司。
二、单细胞cDNA合成
- 第一次使用本试剂盒时，需要制备3个浓度的阳性对照。在2个离心管中，分别标注E2和E1，各加入45μL模板稀释液。在试剂盒提供的E3 PC冻干粉管中，加入50μL模板稀释液，涡旋2分钟混匀，然后取5μL到E2管中，涡旋2分钟混匀，然后取5μL到E1管中，涡旋2分钟混匀，放冰上待用。未用完的必须放-80℃保存。阳性对照只在第一次使用本试剂盒或者分析原因时使用。
- 在0.2mL管中，设置如下反应。如果有N个样本，则设置N+4个反应管，3.其中一个是阴性对照，三个是阳性对照。后面4个反应也可以不做。
成份 NC管 样本管 PC1管 PC2管 PC3管 自备单细胞悬液 - 1μL - - - RT磁珠 1μL 1μL 1μL 1μL 1μL 超纯水 1μL E1 PC（第2步） - - 1μL - - E2 PC（第2步） - 1μL - E3 PC（第2步） - - 1μL 70℃1.5分后速放冰上，然后加入 磁珠RT反应液1 2.5μL 2.5μL 2.5μL 2.5μL 2.5μL 磁珠RT专用酶 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 50℃保温60分钟，65℃保温15分钟。 磁珠RT反应液2 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 37℃保温10分钟，95℃3分钟，60℃3分钟，75℃30分钟。 加细胞悬液时最好使用显微操作系统，确保至少有1个细胞加入到管中，细胞数不要超过500个。 - 所得产物为双链cDNA。可以直接用于下一步实验，建议各取1μL NC和PC管中样本到9μL超纯水中，用户后续的扩增效率比较。
三、第一轮cDNA扩增
- 用磁力架将磁珠吸附1分钟到管壁，吸走管底液体。
- 加入100μL磁珠IVT预洗液，轻柔重悬磁珠。
- 用磁力架将磁珠吸附1分钟到管壁，吸走管底液体。立即进入下一步，避免磁珠干燥。
- 将磁珠迅速悬浮在10μL 2×磁珠IVT反应液中，9μL超纯水，最后加入1μL磁珠IVT酶。
- 37℃保温3小时。
- 用磁力架将磁珠吸附1分钟到管壁，将上清（含mRNA）分别转移到N+4个新的离心管中进入下一步。迅速用100μL磁珠IVT预洗液重悬磁珠，避免干燥，放冰上待用。如果长期不用请放4℃保存。
- 各加入60μL微量核酸沉淀剂，吹打10次混匀后14000g离心15分，离11.心前标注离心时的离心面。小心将上清转移到新离心管中（等实验结束，确保RNA回收后，再扔掉此上清）。
- 在沉淀中加入1mL自备的75%乙醇，颠倒10次混匀，14000g离心3分.放入离心机时，确保离心面跟上步一致。
- 小心移弃上清。
- 短暂离心，小心移弃管底残留液体（约50μL）。
- 加入50μL超纯水溶解mRNA沉淀，取1μL进行Nano Drop测定其浓度，计算50μL中有多少μg mRNA。如果浓度非常低，请跟厂家联系。一般一个单细胞能得到5μg mRNA。
- 确认得到mRNA后，按下表设置逆转录反应。每个样本最好设置4个独立的逆转反应重复，以便避免逆转录的偏差。下表是以一个样本为例：
成份 NC管 重复1 重复2 重复3 重复4 mRNA（上步） - 1μg 1μg 1μg 1μg 4×RT反应液 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL 超纯水 1μL - - - - MMLV酶 1μL 1μL 1μL 1μL 1μL 补超纯水到 20μL 20μL 20μL 20μL 20μL - 短暂离心，50℃保温60分钟，65℃保温15分钟。所得产物为mRNA-cDNA杂交链。如果需要去除RNA，可以用自备的RNase酶降解。如果RNA不影响后续使用，建议以RNA-DNA杂交链的形式保存更好（否则单链cDNA容易自我形成区域杂交）。
- 检测cDNA的扩增效率：各取1μL NC和PC的扩增产物到9μL超纯水中，和第4步留存的对照一起进行PCR扩增，检测模板的扩增倍数。在PCR管中，各加5μL待测模板，10μL 2×Probe PCR Mix，3μL引物探针混合液，2μL超纯水，进行PCR。PCR参数是95℃ 3分钟，（95℃ 30秒，60℃15秒，收集FAM通道的荧光信号，40个循环）。NC应该没有Ct或Ct大于35，扩增后的样本的Ct应该比扩增前的大12以上（模板扩增了上万倍）。如果不符合，请跟厂家联系。
四、第二轮或更多轮cDNA扩增
- 如果还要继续扩增cDNA，则直接在第10步保留的磁珠重悬液中加入1μL磁珠IVT专用T7 RNA聚合酶。此磁珠-cDNA可以反复使用5次。
- 重复第11步到第18步的cDNA扩增及检测步骤。
相关搜索：单细胞cDNA扩增试剂盒(T7体外转录法)，Single Cell cDNA Amplification Kit